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黃曲霉毒素總量(Aflatoxin Total)ELISA檢測試劑盒說明書

【概要】

黃曲霉毒素是一類真菌（主要是黃曲霉和寄生曲霉）代謝的有毒產(chǎn)物，主要存在于谷物，堅(jiān)果，棉籽以及一些與人類血液，動(dòng)物飼料相關(guān)的產(chǎn)品中。黃曲霉毒素以AFB1、AFB2、AFG1和AFG2這四種毒素為主，黃曲霉毒素總量一般是指這四種毒素的總量。它們是I類致癌物，被證明對人和動(dòng)物的肝臟、腎臟等組織和器官具有很大的危害，是一類毒性很強(qiáng)的致癌物質(zhì)。因此，必須對其進(jìn)行及時(shí)檢測監(jiān)控，目前主要的檢測手段是高效液相色譜法。（HPLC）

本產(chǎn)品是基于免疫競爭法檢測原理建立的一種快速定量檢測黃曲霉總量的試劑盒。它具有簡單、快速，無需特殊儀器設(shè)備等優(yōu)勢，既可以用于實(shí)驗(yàn)室檢測，也可在農(nóng)場、飼料混合車間等進(jìn)行實(shí)地測定。

【適用范圍】

可定性、定量檢測玉米、大米、麥類、豆類、花生、飼料、食用油等樣本中的黃曲霉毒素總量。

【試驗(yàn)原理】

本試劑盒采用競爭ELISA，在微孔板上預(yù)包被黃曲霉毒素抗原，加入樣本/黃曲霉毒素總量標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素總量抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的黃曲霉毒素與預(yù)包被在微孔板上的黃曲霉毒素抗原競爭結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素總量抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時(shí)被除去，再加入TMB顯色液，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素總量的含量成負(fù)相關(guān)。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉毒素總量的含量。

【試劑盒靈敏度】

   試劑盒靈敏度：0.1ppb

【交叉反應(yīng)率】

   結(jié)構(gòu)類似物                                                               交叉反應(yīng)率

  黃曲霉毒素B1   ……………………………………………………………  100%

  黃曲霉毒素B2   ……………………………………………………………   75%

  黃曲霉毒素G1   ……………………………………………………………  100%

  黃曲霉毒素G2   ……………………………………………………………   97%

  黃曲霉毒素M1  ……………………………………………………………   30%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（2ml/瓶）

    0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb

3. 酶標(biāo)物1瓶  …………………………………………  6ml

4. 顯色液1瓶 …………………………………………  12ml

5. 終止液1瓶  ………………………………………… 10ml

6. 濃縮洗滌液 （10×）1瓶………………………… 50ml

7. 濃縮樣品稀釋液（10×）1瓶 ……………………50ml

8. 濃縮樣品稀釋液（10×）1瓶 ……………………25ml

【需要而未提供的設(shè)備及試劑】

設(shè)備：

┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm

┅┅振蕩器

┅┅氮吹儀

┅┅粉碎機(jī)

┅┅離心機(jī)

┅┅微量天平：感量0.01g

┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl、 多道300μl

試劑：

┅┅甲醇（分析純）

┅┅石油醚

┅┅去離子水（或蒸餾水）

┅┅乙腈

┅┅NaCl

【試劑配制】

1. 樣品稀釋液：將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水）。

2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水）。

3. 谷物稀釋液：將0.9gNaCl用配制完成的樣品稀釋液溶解并定容至100ml。

4. 啤酒稀釋液：取無水甲醇，用配制完成的樣品稀釋液按1:4體積比進(jìn)行稀釋（1份甲醇+4份樣品稀釋液）。

5. 50%甲醇：取無水甲醇，用去離子水按1:1體積比進(jìn)行稀釋（1份無水甲醇+1份去離子水）。

【樣本前處理步驟】

一、 谷物（大米、玉米、小米等低脂含量）（稀釋倍數(shù)：8）

1. 取1.0g粉碎的樣品與8ml 谷物稀釋液混合均勻；

2. 強(qiáng)力振蕩3min；

3. 5000g離心10min；

4. 取上清液100μl待測。

二、 蛋糕（稀釋倍數(shù)：10）

1. 取1.0g粉碎的樣品與4ml 50%甲醇混合均勻；

2. 強(qiáng)力振蕩3min；

3. 5000g離心10min；

4. 取400μl下層液體，加入600μl樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，充分混勻；

5. 取100μl稀釋后液體待測。

三、 花生、奶油蛋糕（稀釋倍數(shù)：10）

1. 取1.0g粉碎的樣品與4.0ml石油醚混合均勻；

2. 加入4ml 50%甲醇混合均勻；

3. 強(qiáng)力振蕩3min；

4. 5000g離心10min；

5. 取400μl下層液體，加入600μl樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，充分混勻；

6. 取100μl稀釋后液體待測。

四、 食用油（稀釋倍數(shù)：10）

1. 取1.0g樣品與4.0ml石油醚混合均勻；

2. 加入4ml 50%甲醇混合，振蕩1min；

3. 靜置10min；

4. 取400μl下層液體，加入600μl樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，充分混勻；

5. 取100μl稀釋后液體待測。

五、 飼料、面粉、湯圓（稀釋倍數(shù)：24）

1. 取3.0g粉碎的樣品與9.0ml 80%甲醇混合均勻；

2. 強(qiáng)力振蕩3min；

3. 2000g離心10min；

4. 取上層清液100μl，加入700μl樣品稀釋液，混合均勻；

5. 取100μl稀釋后液體待測。

六、 啤酒（稀釋倍數(shù)：5）

1. 取200μl啤酒樣品（去除CO2），加入800μl啤酒稀釋液；

2. 振蕩3min；

3. 取100μl稀釋后液體待測。

七、醬油、醋、葡萄酒（稀釋倍數(shù)：8）

1. 取0.5ml樣品，加入0.5ml蒸餾水并加入4.0ml三氯甲烷；

2. 混勻振蕩3min，5000g離心10min；

3. 取1.0ml下層液，60℃氮?dú)獯蹈桑?

4. 加入100μl乙腈溶解干燥物，并加入900μl樣品稀釋液，充分混勻；

5. 取100μl稀釋后液體待測。

【檢測步驟】

一、 測定前須知：

1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。

2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2～8℃，干燥環(huán)境保存有利于保持試劑穩(wěn)定性。

3. ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點(diǎn)。

4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

二、操作步驟：

1. 將所需試劑及微孔板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。

2. 取出所需數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷凍。

3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。

4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。

6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。

7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。

8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。

【結(jié)果判定】

1. 百分吸光率的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素總量標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素總量實(shí)際量。

【注意事項(xiàng)】

1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有恢復(fù)到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3. 每種試劑使用前均需搖勻。

4. 反應(yīng)終止液為0.5M硫酸，避免接觸皮膚。

5. 不要使用過了有效期的試劑盒；也不要摻雜使用過了有效期的試劑盒；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

6. 儲(chǔ)存條件：

試劑盒保存于2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新真空密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的顯色劑對光敏感，因此要避光保存。

7. 試劑變質(zhì)的跡象：

顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8. 加入顯色液后，一般顯色時(shí)間為15～30min。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時(shí)間到35min（或更長），但不得超過40min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。

9. 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【樣品最低檢測限】

    谷物 ………………………………………………0.8ppb

    蛋糕 …………………………………………………1ppb

    花生、奶油蛋糕……………………………………1ppb

    食用油 ………………………………………………1ppb

    飼料、面粉、湯圓………………………………2.4ppb

    啤酒  ………………………………………………0.5ppb

    醬油、醋 …………………………………………0.8ppb

【貯藏條件及保存期】

貯藏條件：保存試劑盒于2～8℃。

保存期：該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。